定点诱变 |鼻 NEB官网

来自 : 发布时间：2025-04-27

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定点诱变 (SDM) 是一种在双链质粒 DNA 中产生特异性、靶向性变化的方法。进行特定 DNA 改变（插入、删除和替换）的原因有很多，包括：

研究因 DNA 操作而发生的蛋白质活性变化。选择或筛选突变（在 DNA 上，具有所需特性的 RNA 或蛋白质水平）引入或去除限制性核酸内切酶位点或标签

方法概述：SDM 是一种体外程序，它使用定制设计的寡核苷酸引物在双链 DNA 质粒中赋予所需的突变。以前，一种由 Kunkel (Kunkel, 1985) 开创的方法利用了 dUTPase 和尿嘧啶脱糖基酶缺陷的菌株，使受体大肠杆菌降解含有尿嘧啶的野生型 DNA。目前，有许多市售试剂盒也需要特定修饰和/或独特的大肠杆菌菌株（例如，Thermo 的 Phusion Site-Directed Mutagenesis® 和 Life 的 GeneArt® 系统）。最广泛使用的方法不需要任何修改或独特的菌株，并通过使用标准引物的反向 PCR 将突变整合到质粒中。对于这些方法，引物可以设计为重叠（QuikChange®，安捷伦）或背对背方向（Q5® 定点诱变试剂盒）（图 1）。重叠引物设计产生的产物将重新环化以形成双切口质粒。尽管存在这些缺口，但这种圆形产品可以直接转化为大肠杆菌，尽管效率低于非切口质粒。背靠背引物设计方法不仅具有转化非切口质粒的优势，而且还允许指数扩增以产生明显更多的所需产物（图 2）。此外，由于引物彼此不重叠，删除大小仅受质粒限制，插入仅受现代引物合成的限制。目前，通过在两个引物之间拆分插入，使用这种方法通常可以在一个步骤中创建高达 100 bp 的插入。

在设计引物之前，重要的是确定要采用哪种诱变工作流程用过的。在这里，我们对三种市售套件（图 3）进行了比较，并对重要功能进行了简要说明。

在您计划下一次 SDM 实验之前，请务必通读我们的重要实验注意事项列表。

图 1：位点特异性诱变过程不到 2 小时 使用主混合物、独特的多酶 KLD 酶混合物和快速聚合酶可确保对于大多数质粒而言，诱变反应完成于不到两个小时。图 2：Q5 定点突变试剂盒概述 该套件专为快速有效地整合插入、删除和替换而设计进入双链质粒 DNA。第一步是使用标准引物和 master mi 进行指数扩增x Q5 热启动高保真 DNA 聚合酶的配方。第二步涉及与包含激酶、连接酶和 DpnI 的独特酶混合物一起孵育。这些酶一起允许 PCR 产物的快速环化和模板 DNA 的去除。最后一步是高效转化为化学感受态细胞（已提供）。图 3：Q5 定点突变试剂盒的引物设计通过使用专门设计的正向（黑色）和反向（红色）引物将替换、删除和插入整合到质粒 DNA 中。与依赖线性扩增的试剂盒不同，为 Q5 定点诱变试剂盒设计的引物不应重叠，以确保实现指数扩增的优势。 A）替换是通过合并创建的正向引物中心所需的核苷酸变化（用 * 表示），包括突变 3´ 侧至少 10 个互补核苷酸。反向引物的设计使两条引物的 5\' 末端背对背退火。 B) 删除是通过设计位于要删除区域两侧的标准、非诱变性正向和反向引物来设计的。 C) 少于或等于 6 个核苷酸的插入被整合到正向引物的 5´ 端，而反向引物与正向引物互补区域的 5´ 端背靠背退火。 D) 可以通过将所需插入的一半合并到两个引物的 5´ 端来创建更大的插入。插入的最大大小在很大程度上取决于寡核苷酸合成限制。

参考：

Kunkel, T.A. (1985) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 82(2):488-492。 PMID：3881765

选择类型：ProtocolsApplication NotesTools & ResourcesPublicationsLegal InformationProtocolsApplication Notes Tools & ResourcesPublicationsLegal InformationProtocols for Site Directed Mutagenesis5 Minute Transformation Protocol using NEB 10-beta Competent E. coli (C3019H/C3019I)High Efficiency Transformation Protocol using NEB 10-beta Competent E. coli（高效）（C3019H/C3019）一） Q5® 热启动高保真 2X 主混合物优化限制性核酸内切酶反应方案控制反应方案 (E0554)Q5® 定点诱变试剂盒方案 (E0554)Q5® 定点诱变试剂盒快速方案 (E0554) 控制反应方案 (E0552) )Q5® 定点诱变试剂盒（无感受态细胞）方案 (E0552)Q5® 定点诱变试剂盒（无感受态细胞）快速方案 (E0552)KLD 酶混合反应方案 (M0554)定点诱变应用说明改进方法site-directed mutagenesis using Gibson Assembly® Master MixImproved 方法用于定点诱变使用NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix工具与资源手册分子克隆技术指南故障排除指南克隆故障排除指南与定点诱变相关的出版物Yafeng Li, Delu Song, Ying Song, Liangliang Zhao, Natalie Wolkow, John W Tobias, Wenchao Song, Joshua L Dunaief(2015)Iron - 通过视网膜色素上皮细胞中的非典型转化生长因子 (TGF)-β 信号诱导局部补体成分 3 (C3) 上调。生物化学杂志；290，11918-34。 PubMedID：25802332，DOI：10.1074/jbc.M115.645903法律信息

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