使用 Lipofectamine® RNAiMAX 系统将 EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) 转染到贴壁细胞中 |鼻

来自 : 发布时间：2025-04-27

HomeProtocols使用 Lipofectamine® RNAiMAX 系统将 EnGen®Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) 转染到贴壁细胞中使用 Lipofectamine® RNAiMAX 系统将 EnGen®Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) 转染到贴壁细胞中概述：

EnGen Spy Cas9 HF1 包含猿猴病毒 40 (SV40) T 抗原核定位序列 (NLS) 位于蛋白质的 N 和 C 末端，可用于体内产生靶向基因组修饰。有几种方法可以将 Cas9-单向导 RNA 复合物引入细胞。在这里，我们介绍了一种使用 Thermo Fisher Lipofectamine® RNAiMAX 转染试剂将 Cas9 RNP 复合物引入 HEK293 FT 细胞的方法。这是一种\"反向转染”方法，在 96 孔培养板中每次转染使用最终浓度为 10 nM RNP。

所需材料：

细胞培养和转染

HEK293 细胞（或其他细胞系）在 T-75 培养瓶中达到 70-90% 的融合度EnGen®Spy Cas9 HF1（NEB #M0667）sgRNA 包含感兴趣区域的靶向序列gRNA 可以使用 EnGen sgRNA 合成试剂盒生成，化脓性链球菌（NEB #E3322S）sgRNA 必须包含与 Protospacer Adjacent Motif 相邻的目标序列（20 个核苷酸） (PAM, NGG) 在目标 DNA 中。有关详细信息，请参阅 EnGen sgRNA 合成试剂盒手册。Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂 (ThermoFisher) 无菌 1X PBS，不含 Ca2+ 和 Mg2+DMEM，含 Glutamax（或合适的生长培养基），含 10% FBSOptimem 减血清培养基 (ThermoFisher)96 孔培养板

DNA 提取和基因组编辑分析

EnGen 突变检测试剂盒 (NEB #E3321S)Epicentre QuickExtract™ DNA 提取溶液 (Epicentre #QE09050) 开始之前：我们强烈建议戴手套并使用无核酸酶管和试剂以避免 RNase 污染。可在此处找到避免核糖核酸酶污染的更多建议：https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/avoiding-ribonuclease-contamination转染条件可能变化很大。建议针对您可能拥有的每种细胞类型和 Cas9 靶标优化您的条件。该协议遵循已针对特定目标和 HEK293 细胞协议的使用进行优化的条件：

RNP 复合物形成

通过用无核酸酶水稀释储备液来制作 3 µM sgRNA 工作溶液。制作 3 µM通过使用 1X NEBuffer r3.1 或 Optimem 稀释 Spy Cas9 HF1 的工作溶液。形成如下所示的 RNP 复合物： 组分单反应 x3.3（三联） sgRNA (3 μM) 0.5 μl 1.65 μl EnGen Spy Cas9 HF1(3 μM ) 0.5 μl 1.65 μlOptimem 11.5 μl 37.95 μl 总计 12.5 μl 41.25 μl 轻轻混合反应液并在室温下孵育 10 分钟。如下形成脂质体复合物。您可以制作 RNAiMAX 和 Optimem 的预混液，然后从上方将其直接添加到 RNP 管中。组分单一反应 x3.3 (TRIPLICATES) RNP (120 nM) 12.5 μl 41.25 μl RNAiMAX 1.2 μl 3.96 μlOptimem 11.3 μl 37.29 μl 总计 25 μl 82.5 μl 轻轻混合反应液并在室温下孵育 10 分钟。如下形成脂质体复合物。您可以混合 RNAiMAX 和 Optimem，然后将其从上方直接添加到 RNP 管中。轻轻混合反应液并在室温下孵育 20 分钟。

胰蛋白酶消化并制备 HEK293 细胞

接种细胞以便它们在转染当天达到大约 70-90% 的汇合度。在 RNP/脂质体孵育期间，用胰蛋白酶消化细胞，洗涤一次以去除胰蛋白酶的任何痕迹。在 10 ml 培养基中重悬细胞并计数。计算使细胞达到 3.2 x 105 个细胞/ml 所需的稀释度和体积。每孔需要 125 µl 细胞。

用脂质体复合物转染细胞

从每管 RNP/脂质体复合物中分装 25 µl 到 96 孔板的 3 个孔中。添加 125 µl 细胞(3.2 x 105 个细胞/ml) 加入含有 RNP/脂质体复合物的每个孔中，轻轻上下移液几次。将细胞在 37°C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育 48-72 小时。

收获DNA 和扩增目标区域

从细胞中轻轻吸出培养基并用 100 μl 1X PBS 洗涤两次。加入 75 µl Epicenter QuickExtract DNA Extraction Solution 并摇动/涡旋 5 分钟。将溶液转移到 PCR 板或试管中并放入热循环仪中，运行以下程序：

65°C 15 分钟95°C 15 分钟保持在 4°C

用核酸酶 1:10 稀释 DNA -无水。遵循 EnGen 突变检测试剂盒 (NEB #E3321) 手册中详述的方案。此资源的链接产品类别：突变检测试剂和试剂盒、sgRNA 合成试剂和试剂盒、基因组编辑产品、核酸外切酶和非特异性核酸内切酶产品, DNA 修复酶和结构特异性核酸内切酶产品, 可编程核酸酶, RNA 合成 Pr产品应用：基因组编辑应用、克隆与合成生物学相关产品：EnGen Spy Cas9 HF1